此前，“袁来如此”专栏就LBA定量方法的监管验证展开了第一、二期的详细介绍，本期将延续前两期的内容，继续分享后续相关内容。

在方法开发之前或期间，应确定最低可接受的准确度和精密度，并在该分析方法的生命周期内使用，同时应用适当的统计方法计算运行内和运行间的精密度（precision）和方法准确度（平均偏差mean bias）。表 VII A 中提供了适用于方法开发和研究前验证数据计算的示例，表 VII B提供了相关公式。

表 VII A . 准确度和精密度的示例。重复多孔分析的结果来自一个蛋白药物的免疫分析数据。在Excel电子表格中，使用方差分析（ANOVA）计算了相关统计结果。所有数据的符号表示法在表VII B中列出。

表 VII B.表VII A.中数字示例的符号表示法

运行内精密度：从计算的运行平均值，估算测定浓度值的混合运行内标准方差（SW）。总随机误差，通常称为运行间精密度（或中间精密度intermediate precision），从所有运行的累积平均值，估算所有测定的浓度值的标准方差（）。如出现后一个标准方差稍微低估了真正的运行间的非精密度（imprecision），使用方差分析（ANOVA），则能够计算更准确的数值 （SIP）（见表VII A）。

方法的准确度（表示为%RE）由加权样品平均值（weighted sample mean）与样品标称参考值μT（sample nominal reference value， 50ng/mL in表VII A）的百分比偏差（percent deviation）确定。当所有分析运行的重复孔数相同时，加权平均值（weighted mean）和样品总体平均值（ sample overall mean）相等，将标准方差除以样品标称值，即得出精密度，以%CV作单位记录。

在某些应用场景中，例如当基质中存在内源性化合物且无法剔除时，则没有标称值可用；因此，必须用计算出的样本平均值替换%CV计算中的标称值。在这种情况下，在验证之前，还必须科学合理地计算回收率，并将其用于评估准确度。

在方法开发的早期，可以计算校准品的%CV和平均RE，预测该分析方法可能达到的精密度和准确性的最佳值。

要得到预期分析性能更可靠的评估，可以独立制备额外的加标对照样本组，并至少进行3次分析运行。所制备的样品的浓度应包括校准品的整个范围（例如，6至9个浓度点），对每次运行中的每个浓度点，至少进行复孔（duplicate）测定。由内插计算得出的样品浓度，将反映来自校准品的变异性、来自样品制备和位置等其他因素的变异性。表VI中所建议的每个浓度的累积 %CV和绝对平均RE（平均偏差mean bias）的目标限度为20%（LLOQ为25%），这与研究前验证评估时的精密度和准确性的目标限度相同。

在研究前验证期间，可通过分析验证样品确认方法精密度和准确性。在预期未知样本的基质中，制备5个或更多浓度的验证样品如下：预期的定量下限（LLOQ）、小于LLOQ的1/3的浓度、中浓度、高浓度和预期的定量上限（ULOQ），建议再进行最少6次分析，对每次运行的每个样本至少进行2次独立分析(复孔)。对于每个验证样品，应使用适当的统计方法一起分析所有运行的复孔测定值（请参阅表VII）。

如认为方法可以接受，建议运行间精密度（%CV）和绝对平均偏差（%RE）均须 ≤20%（LLOQ 为25%）。此外，建议将方法总误差（%CV和绝对%RE的总和）定为≤30%（LLOQ为40%），以符合研究中验证的接受标准。

每个研究中运行的精密度和准确性是通过评估QC样品的分析结果来监控的。对于色谱类和LBA方法都采用同样的运行接受标准：每个运行至少需要2/3的QC达到对应的标称参考值的特定百分比（例如15%、20%、25%或 30%）；至少50%QC样品的分析结果在指定的限度范围内。对于传统小分子药物的定量分析，一般采用4-6-15规则，相比之下，在2000年3月的AAPS研讨会上，建议对大分子的LBA制定4-6-30规则，本文建议采用4-6-30 规则。

建议采用研究前验证部分中描述的精密度和准确度的接受标准，因其计算简单，并与上述研究中的4-6-30 规则相当一致。根据定义，4-6-30 的接受标准仅基于单个定量结果与其标称值的偏差，而不是基于计算的平均值或标准方差，由于分析结果与标称值的偏差包括随机误差和系统误差，因此它是一个总误差的度量（图4）。

图4. 定量分析结果总误差（z）的说明。总误差定义为分析结果与其标称“真实”值 (μT)的偏差（deviation）。一般假定均匀样品的重复测定结果的误差服从钟形的正态分布。为便于比较，误差通常表示为百分比相对误差 (参见图中刻度)；计算方法是将偏差除以标称值，再乘以100。总误差等于系统误差的总和（systematic component，由计算出的分析平均值与标称值的偏差来估计），再加上随机误差（random component，由一个分析结果与分析平均值的偏差来估计）。

附加的研究前验证的限制条件，即%CV和绝对%RE的总和≤30%，以防止接受具有高度不精密（imprecision）和高度偏差（bias）的分析结果(例如接近20%)。这样的分析方法往往不能通过4-6-30标准。其它确保研究前和研究中接受标准之间的一致性的统计方法亦可接受。

对于免疫测试和其它LBA方法，其定量范围应基于最低（LLOQ）和最高（ULOQ），满足目标精密度和准确度标准的验证样品，而不是校准品的性能。

用于定义定量范围的验证样品是在未稀释的样本基质中制备的。在分析之前，它们可能需要进行最低限度的稀释（minimal required dilution，MRD）。在需要使用 MRD 的情况下，可以将定量范围定义为纯粹基质中的标准浓度值，或者定义为应用 MRD 后获得的标准浓度值范围。例如在纯粹基质中，10至100 ng/mL 的校准曲线等效于应用倍数为10的MRD（即10%基质）之后，1到10 ng/mL的校准曲线范围。

在方法开发早期，可以使用回算的标准品浓度值初步估计定量范围。稍后，则使用加标样品来优化之前估计的定量范围。在此阶段，在预期的LLOQ和ULOQ浓度附近分析更多浓度点是有益的。精度剖面图有助于评估定量范围的预期极限（图5）。

应根据外加待测物的验证样品（spiked validation sample）分析结果的精密度和准确性来建立该分析方法的定量范围。标准曲线应包括跨越预期的LLOQ和ULOQ的浓度。LLOQ 和 ULOQ 由最低和最高的验证样本决定，其精密度（运行间%CV）和准确度（绝对%RE）均≤20%（LLOQ为25%），两者的总和≤30%。

在研究前验证时，确定的定量范围是在必要时，样本稀释后必须达到的范围。对高于ULOQ的样本，必须增加稀释的倍数后重新分析。如果样本已达到最低稀释要求，且低于最低定量限，则必须报告为＜LLOQ。在样本分析期间，如果对标准曲线的必要编辑导致没有标准品达到或低于经过验证的LLOQ，则必须提升LLOQ。在这种情况下，需要将LLOQ上调到其余标准品中的最低浓度。

在研究前的验证中，必须证明待测物在样本基质中的稳定性。稳定性试验应尽可能模拟研究样本的收集、储存和处理的条件。通常是将待测物添加到全血（whole blood）以及经过处理全血得到的基质，如通过血浆（plasma）和/或血清（serum）进行评估的。对制备和储存条件的评估，通常包括工作台稳定性（bench-top stability）、短期和长期稳定性以及多个冻融循环的稳定性。在确定操作条件时，应考虑分析物的理化性质，还必须建立待测物的初级标准溶液在相关存储条件下的稳定性。

稳定性样品必须与在与采集到的研究样本相同的基质中制备。如果使用剥离或改变了的基质制备研究前校准样品和QC样品，则仍必须在未改变的基质中制备稳定性样品。在分析方法开发过程中，制备稳定性样品对研究前验证期间的中、长期稳定性数据的收集有极大的积极作用。因此，在合适的实验室中尽早制备稳定性样品并保存相关文档记录，可以为建立待测物的长期稳定性提供一个良好的开端。稳定性评估可在方法开发过程中的样本处理阶段进行，包括但不限于对基质稳定性的评估：如室温、冻融循环等，以确定在分析方法的整个生命周期中如何处理样品。

正式的稳定性评估必须在研究前验证中使用已建立的分析方法进行。制备稳定性样品时，必须将待测物加入到与研究样本相同的基质中，以产生高/低浓度的稳定性样品，这些浓度可以与高/低QC浓度相同。建议使用与QC样品相同的重复孔数来分析稳定性样品。

评估工作台稳定性时，要求处理样品的方法与样本收集（研究）和分析现场的处理方法相同，并且应在室温(至少2小时)和冰箱温度(2°至8°C)(至少24小时)下进行。研究人员可将分析物加入新鲜采集的全血来评估其全血稳定性。

以评估全血待测物稳定性为例，全血样品中加入分析物，孵育2小时，每隔一段时间进行样本处理以获得血浆或血清；之后，监测处理后样品的回收率的趋势来评估其稳定性。

对于冻融稳定性评价，应考虑在常规分析中预期的冻融循环次数。标准的方法是3次冻融循环，每次解冻间隔不少于12小时。冻结和解冻的速度和冷冻储存的温度应该模拟样品在分析前解冻时的处理方式。评估长期的稳定性必须考虑到样本在研究现场和测试设施的储存。在研究的整个生命周期中，包括研究样本的分析完成之后，样本都必须是稳定的。测试的时间间隔则取决于研究的需要，对于非常长期的研究，测试频次以比样本分析更密集，以确保可以分批次分析样本，直到整个研究结束。

对于保存在-20°C和-70至-80°C样品是否需要进行稳定性进行研究，可能取决于样本在-20°C保存的时间。如果在-20°C冷冻样本，在-80°C储存，那么稳定性样品应该以同样的方式制备，在-20°C保存的时间可以建模，以预测其稳定性。

新鲜制备的标准校准曲线和QC样品（无论是在可接受的失效期内或新鲜制备的），可以作为稳定样品的比较标准。除了全血稳定性外，稳定性的接受标准与用于QC样品准确度和精密度的接受标准相同。如果稳定性样本的测定值在精密度的接受标准之内，那么样本就被认为是稳定的，即便观察到稳定性变化的某种趋势，可以采用其他评估方法，如使用置信区间。在这种情况下，当观测到的稳定性样品的浓度或响应超出了置信区间的低端，则该样本不再有效。

通常在研究中验证期间，会继续进行稳定性评估。如果研究样品的处理和储存条件发生变化，则必须进行额外的稳定性评估，以反映新的条件对稳定性的可能影响。如果无意中将样品储存在不同的温度下，则应该在样品分析之前进行该温度下的稳定性研究，以确认稳定性，并通过更新方法验证报告的形式进行书面体现。当一个时间点的稳定性数据表明样本失稳时，只要有一个预先建立的、确认稳定性趋势的方案, 则仍然可以在直到样品失稳的时间点以内的时间段进行样品分析；如果下一个稳定性时间点的样本分析，否决了之前的样本稳定性趋势， 则可以延长样本的稳定性区间。

由于许多免疫测试方法性质或格式中的标准曲线定量范围(LLOQ到ULOQ)可能很窄，有时甚至<1个数量级。因此，有必要证明，当待测物的浓度超出定量范围（高于ULOQ）时，可以稀释样本，使待测物的浓度进入经验证的定量范围。进行稀释实验的另一个原因是为了识别可能存在的“prozone”或“钩状效应”(参见图6所示，即由高浓度待测物引起的信号抑制)。

稀释线性（dilutional linearity）不应与平行性（parallelism）相混淆。平行性必须使用incurred sample，即已测样本再分析的真实样本，进行评估，而稀释线性可以使用外加待测物的QC样品进行评估。如果在研究前的验证中显示出稀释线性，那么在研究中验证时就不需要使用系列稀释的QC样品了。

图6.钩状（Prozone）效应的演示。两个结合点EIA的典型S形浓度-响应曲线(●)，包括高浓度钩状效应。具体来说，高浓度的待测物产生了低于预期的响应。如果没有钩状效应，如开环(○)所示，较高的待测物浓度将产生 > ULOQ响应；如果没有钩状效应，曲线的量化范围在LLOQ和ULOQ之间。LLOQ和ULOQ之外的锚定点仅用于曲线拟合。