上周，“袁来如此”专栏就大分子生物分析方法的校准曲线的设计、生成和编辑的思考和建议展开了详细介绍（袁来如此｜大分子生物分析概论（四_上）：校准曲线的设计，生成和编辑），本期将延续上期内容，重点介绍大分子生物分析方法校准曲线拟合模型和权重进行取舍的方法。

本系列文章介绍的生物分析是指定量地测定在动物和人体体液或组织中的生物药（本文特指蛋白质类生物药，包括单抗，细胞因子，生长素，融合蛋白等）的浓度。大多数生物分析方法都基于免疫测试方法（Immunoassays），或者更广义地称为，配体结合式测试方法（ligand binding assays, LBA）。这些方法涉及一系列试剂的使用，如抗药物抗体，其它抗体，生物药的靶标蛋白等。

配体结合式测试方法（LBA，也称为immunoassays）是一种常用的定量分析工具。在LBA方法中，待测物浓度与响应数据之间的关系是质量作用定律驱动的非线性关系，两个被广泛接受和经过验证的LBA校准曲线的回归模型是4参数logistic（4PL）和5参数logistic（5PL）曲线拟合模型。选择适当的回归模型和权重函数是LBA方法开发的关键组成部分。

在分析方法开发期间，应对选定的模型和权重函数进行评估，并在验证期间加以确认。关于确定或选择适当的回归模型和权重函数的实际操作方法，在已发表的文献中颇为有限，本文将提出一个结构化的、有序的方案来确定两者。

在LBA中观察到的实验响应是一个配体（待测物）和检测系统中使用的特定捕获/检测试剂的平衡结合的结果。实验响应与对数变换后浓度之间的这种关系是非线性的，使得典型的LBA校准曲线为全部或部分的S型（sigmoidal）。常见的非线性回归模型为4PL和5PL，拟合模型的选择可能由曲线的形状所驱动。完全的 sigmoidal曲线（其中顶部和底部平台区是镜像）通常使用4PL 模型。部分sigmoidal曲线，即非对称曲线，通常使用5PL模型（4PL、5PL模型详细解读请戳《袁来如此｜大分子生物分析概论（四_上）：校准曲线的设计，生成和编辑》）。

由于LBA中配体平衡结合（equilibrium binding）的特性，经常会观察到测试响应的非恒定的方差（non-constant variance of response），这种不等同方差称为异方差性（heteroscedasticity）。如果在曲线拟合时不考虑应对异方差性，则可能导致最终结果中出现回算错误和更大的偏差。为了减少异方差性的影响并提高曲线拟合的质量，必须尽量减少具有较高方差（higher variance）的校准点对曲线拟合的贡献，广义最小平方 （generalized least squares）和方差稳定变换（variance stabilizing transformation）可以用来解决这个问题。这些方法要么在每个拟合迭代后更新权重函数；要么转换数据和模型，以使用普通最小平方模型，而不使用权重函数。在已发表的方法中，线性回归斜率方法（linear regression slope approach）可能是最实用的。本文下面讨论这个方法。

大多数与 LBA测试相关的软件为各种拟合模型和常用的权重函数（如 1/Y 或 1/Y2）提供了内置的选择。相关监管指南建议使用最简单，并充分描述了待测物浓度与其响应之间关系的模型。在选择回归模型（加或不加权重）时，如果对曲线形状的目视评估和对使用的统计方法进行比较，如比较F测试和chi-square p value，并不容易，其结果可能会令人困惑。这里常见的挑战是如何依据相关知识，合理地选择其中之一。

本文将介绍一组案例研究，其中采用药代动力学定量分析方法，用于血清或血浆中蛋白生物药的定量，以及使用通用的统计软件来确定适当的拟合模型和权重因子。

LBA方法是评估生物药的PK/TK时的主要定量分析方法，该方法的特异性和选择性取决于目标待测物与其他生物分子（如受体、和针对候选生物药的抗体）的相互作用。LBA方法中观察到的信号/响应与生物药的浓度间接相关。

下面的示例A、B和C都使用了LBA方法，如电化学发光（ECL）检测平台或比色法ELISA检测平台，用于定量分析血浆或血清（人或食蟹猴）中的蛋白生物药浓度。每个案例研究中的分析方法简述如下：

案例A：对Meso Scale Discovery（MSD）Multi-Array®微孔板，使用单克隆抗药物抗体（5 g/mL）包板，过夜；之后，与含有药物的样品在室温下孵育60分钟；洗板后，结合到板上的药物与biotinylated单克隆检测抗体（2.5g/mL）孵育60分钟；然后加入0.1g/mL 的Streptavidin-ruthenium，再孵育60分钟；之后，MSD仪器在特定条件下检测到来自ruthenium 的电化学发光信号。

案例B：对streptavidin 包被的MSD Multi-Array®微孔板，在室温下，以biotinylated单克隆抗体（4mg/mL）包板60至120分钟；随后，含有药物的样品在上述微孔板上孵育90分钟；使用小鼠抗人IgG Fc-Ruthenium（0.36mg/mL）孵育60分钟，以结合被抗体捕获的生物药；之后，MSD仪器在特定条件下检测到来自ruthenium 的电化学发光信号。

案例C：在Costar微孔板上，在4°C包被药物靶点（4 mg/mL），过夜；与靶点结合后的生物药，再与50 ng/mL的biotinylated单克隆抗体孵育60分钟；之后，再与1:50,000稀释后的avidin D-HRP 孵育60分钟；随后，加入HRP酶底物，TMB，以产生色度反应；然后用硫酸停止该反应，并在酶标仪Spectramax上，测量450nm的光学密度（OD）。

异方差性（Heteroscedasticity）

在采集到的实验运行的标准校准数据集合（standard calibration data）中，可以通过观察测试信号的标准偏差（SD）和校准点浓度之间的关系来评估异方差性。为此，分别评估了案例A、B和C在方法开发过程中获得的6、7和10个独立运行。

首先，使用Microsoft Excel 2010计算标准方差，其次使用 GraphPad Prizm 7 来绘制每个校准品测试信号的SD与校准点浓度的关系图。在目视考查了SD变化的趋势后，就可以确定对权重函数的需求。如果SD发生移动，则表明了异方差性，因此，需要使用权重函数。如果SD在校准品浓度范围内是恒定的，则无需加权。

当在校准曲线中观察到测试信号的标准偏差随浓度发生变化时，就需要对更精确的数据点（具有较低SD的数据）使用权重函数来调整曲线的拟合。在 GraphPad Prizm 7 中，可以使用图形线性回归方法（graphical linear regression approach）计算权重函数因子如下：

步骤1. 绘制下述二者的关系图：对数转换后的测试信号平均值与对数转换后的SD，对二者使用相同的对数底数（10或2）。

步骤2. 在步骤1中得到的线性回归直线的斜率值（k）乘以2，以确定权重函数因子（weighting function factor），即2k。

为了平衡所有校准点的贡献，在4PL或5PL曲线拟合中应用权重函数 1/Y2k（其中Y是测试信号，2k是权重因子），以尽量减少weighted sum-of-squares，从而获得更好的准确度和精密度。

将权重函数 1/Y2k 应用于曲线拟合模型 （4PL 或 5PL）后，再使用Watson LIMS，将回算的校准点浓度插入加权拟合的曲线（假定这些校准点是未知浓度的样本）。

如果对所有测试运行和对每个标准校准点（锚定点除外），累积%RE在±15% 之内并且累积%CV≤15%，则回归模型是可以接受的；但对于定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ），接受标准一般 %RE±20和累积 %CV≤20。估计的定量范围（ROQ）是在符合上述接受标准的最低和最高标准浓度之间确定的。在 MS  Excel 2010 中，累计%RE和累积%CV 分别计算为：[100 - 100 x（回算浓度的平均值/标称浓度）]和 100 X（回算浓度的标准方差/回算浓度的平均值）。

之后，使用 GraphPad Prizm 7 绘制 4PL 和 5PL 之间准确度（累积cumulative %RE）和精密度（累积cumulative %CV）的比较图。回归模型的适宜性可使用此可视化图形工具来判断：在可接受的范围内包含了更多标准校准点，而且累积 %RE 和累积 %CV 较低模型，就是应该选择的模型。如果两种模型的效能非常相似，则可通过是否具有加权4PL来做选择 ，因为一般遵循 Occam’s razor 原则， 即以最少的假设，发现数据和模型之间的关系。

图1. 选择曲线拟合模型以提高曲线性能的方法。实际工作流程描述了选择权重函数和曲线拟合模型的每个步骤和整个过程。

本文提出了一种结构化的方法，通过选择正确的曲线拟合模型和权重函数，以扩展 LBA分析方法的定量范围（图1）。该方法完全从数学的角度出发，确定一条校准曲线是否需要加权重以及哪种加权方式最合理。如果收集到的数据中呈现出的异质性，则在准确度和精密度行为方面，对4PL和5PL两个模型（以及确定的权重函数）进行比较；如果未观察到异方差性，则对不含权重量4PL和5PL模型进行比较。以下将此原则应用于3个典型 LBA分析案例。在这3个生物药的药代动力学（PK）研究案例中，总共开发了3个分析方法，并观察到3种不同形状的校准曲线。其中，两个分析方法（案例A和B）利用了电化学发光（ECL）平台，而另一个分析方法（案例C）使用了比色ELISA平台。

为了在方法开发过程中对浓度-测试信号的关系进行详细研究，表1中描述了定量分析生物药A、B和C浓度的3条校准曲线。在预期的定量范围内（对数尺度上），校准点大致均匀分布。

表1. 3条PK校准曲线的特征总结

用于评估各自PK分析运行的校准曲线数据如图2所示。在所有3个案例研究中都观察到了典型的非线性的浓度-响应曲线。

图2. 3个案例研究中的校准曲线：案例 A（a），案例 B（b） 和案例 C（c）。该图展示了3条标准曲线的形状，代表了在LBA测试中通常观察到的典型非线性响应。X轴代表校准点浓度的对数，Y轴代表响应读数：案例A和B是相对光单位（RLU），案例C是450 nM 光学密度（OD 450）。

图3. 案例A（a）、案例B（b）和案例C（c）的异方差性概况。X轴代表校准点浓度的对数，Y轴代表实验运行中测试信号的SD。

下面评估了表1中3条校准曲线上测试信号的标准偏差（SD），该SD是异方差性的直接指标。这3条校准曲线上测试信号的SD（变异性variability）不是恒定的，而是随着校准点的浓度而改变化的（图3）。

对于案例A，当药物浓度超过 20 ng/mL时，其变异性急剧增加。在案例B中，SD大幅增加，直到48.3 ng/mL的浓度，并在 48.3和 250 ng/mL 之间出现下降趋势。对于案例C ，SD 增加，一直到23.5 ng/mL的浓度，之后稍微降，直至79.3 ng/mL。总体而言，浓度较高校准点的SD大于浓度较低校准点。校准曲线之间的非恒定 SD 模式代表示异方差性，在较高浓度下的高变异性表明需要使用加权拟合。图1所示的决策树指明了如何确定适当的权重因子和可以接受的拟合模型。

为了确定权重因子，首先需要从下面的线性回归中得出斜率（k值）：对数变换的测试信号SD vs 对数变的换测试信号平均值（图4）；然后，应用 1/Y2k 方程式来计算最终的权重函数。对于案例 A，B 和 C，线性回归的斜率分别为 1.06、1.00 和 0.657。对于案例 A 和 B，由于斜率接近1.0，因此在4PL和5PL模型中使用了权重函数1/Y2 。对于 C 例，权重函数为 1/Y，由于斜率接近 0.5。在Waston LIMS中，只有 1/Y or 1/Y2这两种权重函数可用。

图4. 案例 A（a）、案例 B （b） 和案例 C （c）中k值的确定。案例 A、B 和 C 的斜率（k值）分别为 1.06、1.00 和 0.657。案例A、B和C的R2（确定系数coefficient of determination）分别为0.998、0.984和0.934。

为确定可以接受的曲线拟合模型，考察了如下参数：4PL和 5PL模型；权重函数：1/Y2（案例A），1/Y2（案例B）和 1/Y（案例C）；比较参数：回算浓度的累积 %RE（图5）和累积 %CV（图6）。应当选择在可接受的范围内，具有较低的%CV和%RE校准点数量较多的回归模型。如果两者都是相当的，则应选取加权4PL作为最终的曲线拟合模型。在 Watson LIMS 中生成每次运行的回算浓度。所有情况的回算浓度的累积 %RE和 %CV计算（在曲线拟合模型确定章节的 B 部分）。图5和图6给出了加权4PL模型与加权5PL模型的累积 %RE和累积 %CV的比较。

如图5所示，对于具有相应权重函数的4PL和5PL模型，所有校准点的 %RE分别：案例A， 低于4%和3%；案例 B，低于18%和16%；案例 C，低于7 和 6%。在所有案例研究中，加权4PL和加权5PL模型的准确度是相当的，对于案例 A、B 和 C，所有校准点都在可以接受的范围内。根据准确度行为图推断的定量范围（ROQ）分别为：0.317-178 ng/mL（案例A），0.602-250 ng/mL（案例B），和1.37-79.3 ng/mL（案例C）。

图5. 准确度行为图。对案例A（a）、案例B（b）和案例C（c）中校准曲线的加权（1/Y或者1/Y2）拟合模型进行了比较。比较模型：4PL vs 5PL；比较参数：回算浓度的累积相对误差（%RE）。两条虚线之间的区域是可接受范围（± 20%）。（○）代表4PL加权拟合，（□）代表5PL加权拟合。

图6显示，对于加权4PL和加权5PL曲线拟合模型，所有校准点的累计%CV：案例A，低于3.0和2.9%；案例B，低于39.7%和26.3%；案例C，低于6.6%和10.8%。案例A和C对两个拟合模型加权拟合后，所有校准点的 %CV变得相当了。对案例A和C，所有校准点的加权4PL和加权5PL的精密度也是相似的。根据精密度行为图推断的ROQ分别为0.317-178 ng/mL（案例A）和1.37-79.3 ng/mL（案例C）。使用加权4PL模型，与加权5PL模型相比，案例B可以接受的校准点数量从9增加到11，加权4PL模型的估算的ROQ 为 0.602-145 ng/mL，而加权5PL模型的检测范围较窄：0.602 - 48.3 ng/mL。根据接受标准，对于案例 A、B 和 C ，最终可以接受的曲线拟合模型都是4PL，权重函数分别为 1/Y2，1/Y2和1/Y。

图6. 精密度行为图：案例A（a），案例B（b）和案例C（c）比较模型：加权4PL vs 加权5PL；比较参数：回算浓度的 %CV。虚线和X轴之间的区域是可接受范围（± 20%）。（○）代表 4PL 加权拟合，（□）代表 5PL 加权拟合。

图7演示了对案例 A 应用上述方案后，校准曲线性能是如何改进的（此处不显示案例B和C的图表）。使用非加权4PL回归模型回算浓度绘制的准确度行为图（累积 %RE，图7a）表明，与加权相比此模型表现出更窄的动态范围，0.563-178 ng/mL；加权4PL模型：0.317-178 ng/mL。非加权 5PL回归模型显示更好的准确度：所有校准点低于20%。但是，在应用1/Y2的权重函数（在“异方差度评估”章节确定）后， 所有校准点的累积 %RE得到改善，都在±3%以内（图7a）。

精密度行为图（累积 %CV，图7b）显示，非加权4PL和5PL回归模型的ROQ显著狭窄：1.00-178 ng/mL；而在使用了1/Y2 的权重函数后，ROQ变为0.317-178 ng/mL。该校准曲线低端的效能的显著改善显示了加权拟合的力量，因其降低了高变异性的测试信号对曲线拟合的影响。案例A表明，使用适当的权重函数可以提高精密度和准确度（均低于4%）以及扩展定量范围（0.317-178 ng/mL）。

图7. 案例A标准曲线加权之前和之后，4PL和5PL模型的准确度和精密度行为图。累积 %RE（图 7a）和累计 %CV（图7b）在模型之间的比较：4PL vs. 5PL（无权重）；以及4PL vs. 5PL（权重因子：1/Y2）。

表2显示，使用适当的权重函数可以扩展ROQ。对案例B，应用权重函数到4PL回归模型后，ROQ得到显著扩展；从未加权的1.04-48.3 ng/mL到 加权的0.602-145 ng/mL；加权5PL模型的ROQ，则从未加权1.04-145 ng/mL变为加权的0.602-48.3 ng/mL。对案例C，4PL模型的ROQ略有扩展：从未加权的2.06-79.3 ng/mL，到加权的1.37-79.3 ng/mL。对于5PL模型，使用权重函数后ROQ没有增加。

本文为确定LBA定量分析方法中校准曲线的回归模型及权重函数的选择，提供了一个决策树和相应的方法，目的是为了为减少异方差性（heteroscedasticity）的影响。本文的建议得到3个案例研究的支持。

由于LBA中平衡结合（equilibrium binding）的特性，实践中经常观察到测试响应的非恒定方差，称为异方差性（heteroscedasticity）。本文发现线性回归斜率方法（linear regression slope approach）是解决异方差性最实际的方法。

在方法开发过程中，可以绘制校准曲线的测试信号的标准方差（standard deviation，SD）与校准点浓度的对数的相关图。一条校准曲线的非恒定SD趋势表明存在异方差性，这意味着需要使用权重函数。所有的3个案例研究（A，B 和 C）都显示，测试信号在较高药物浓度下，具有更高的变异性，需要加权拟合校准曲线。一般而言，任何一个LBA定量分析方法，都会受益于使用权重函数。

需要注意的是，一旦确定需要权重因子，如何确定正确的权重因子则成为重中之重。本文推荐的方法是：首先，从测试信号（Y）的标准方差（对数变换后）与测试信号平均值（对数变换后）的线性回归关系中，确定其斜率，又称k值；然后，将斜率（k） 代入以下方程 1/Y2k 中，以确定权重因子（1/Y 或 1/Y2）。

在案例研究 A、B、C 中，线性回归的斜率分别为 1.06，1.00 和 0.657; 因此，权重因子分别估计为2，2和1。在案例A和B中，权重因子为2; 因此，在校准曲线回归模型（4PL或5PL）中，使用了权重函数1/Y2。对于案例C，权重系数为 1; 因此，权重函数为 1/Y。

为了确定可接受的曲线拟合模型，应评估拟合曲线的4PL与5PL模型（不加权和加权）回算浓度的累积 %RE和累积 %CV。应当选择，在可接受的范围内，具有较低的%CV和%RE，校准点数量较多的回归模型。如果两者都是相当的，则选择加权4PL模型作为最终曲线拟合模型，进行方法验证和样本分析。根据 FDA 指南，应当选择假设最少的模型，即选择最简单的模型。根据精密度和准确度数据，在所有3个案例中，4PL都是基于这些标准的最佳回归模型。

为了验证所选择回归模型和权重函数，可以做其他评估。例如，在使用权重函数之前和之后，可以比较4PL和5PL模型的准确度和精密度行为。本文给出了4PL与5PL（无加权和 1/Y2加权）的累积 %CV 和累积 %RE 的比较，累积 %RE的可接受范围为± 20%，累积 %CV 的可接受范围为≤20%。

案例A表明，使用适当的权重函数可以提高精密度和准确性（均低于10%）和扩展定量范围（0.317-178 ng/mL）。在案例B和C中，校准曲线拟合也有改善。案例B在4PL回归模型上加权后，ROQ得到显著扩展：未加权时为1.04-48.3 ng/mL；加权后为 0.602-145 ng/mL；5PL模型，未加权1.04-145 ng/mL，加权后0.602-48.3 ng/mL。案例C4PL模型在加权后ROQ 略有扩展：未加权2.06-79.3 ng/mL；加权为1.37-79.3 ng/mL。

在定量 LBA 方法开发过程中，本文介绍了一个简单、易于使用的决策树，以确定校准曲线的最佳回归模型和权重。所推荐的方法将选择一个加权的曲线拟合模型。

1. 在方法开发过程中，至少需要使用3个独立的测试运行对模型选择进行初步评估; 但是，一般建议增加运行的数量，以便在研究前验证时，验证曲线拟合模型。由于对响应-误差关系的估计存在局限性，因此不建议使用较小的数据集合；

2. 评估异方差性；

3. 如果存在异方差性，就通过斜率方法确k值（即斜率），然后计算权重因子（权重函数=1/Y2k）；

4. 使用准确度（%RE）和精密度（%CV）行为来选择和验证更好的加权回归模型；

5. 建议使用独立制备的质量控制样品（QC）来验证分析方法的定量范围。

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